עם כיבוש גרנדה והשלמת הרקונקיסטה רצו המלכים הקתולים, לבסס את אחדותה הדתית והלאומית של ספרד. כלי מרכזי להשגת מטרה זו היה הקמת האינקוויזיציה הספרדית בשנת 1478.
אף על פי שגם איזבלה תמכה באחדות דתית, היא התנגדה בתחילה לנקיטת צעדים קשים נגד היהודים, מכיוון שהם תרמו רבות לכלכלת ספרד.
ב-31 במרץ 1492 הוצא צו אלהמברה לגירוש היהודים. לאחר ויכוחים ומאבקים פנימיים, נכנעו איזבלה ופרננדו ללחצים הכנסייתיים והלאומניים.