שיטת PCR,שיטת Q-RT-PCR ושיטת PCR-rflp

[amybr]

שיטת PCR,שיטת Q-RT-PCR ושיטת PCR-rflp

אני מנסה עכשיו להבין את עקרון הפעולה של שיטות אלה, ויש לי מס' שאלות: לפי מה שהבנתי לגבי 3 שיטות אלה, לוקחים סליל כפול של DNA, מפרידים אותו, ואז לוקחים כל גדיל בודד ומעבירים בו אנזים רסטריקציה (על 2 הגדילים מעבירים את אותו אנזים רסטריקציה). האנזים חותך כל אחד ואחד מ-2 הגדילים בנקודות שבהן הוא מוצא את אתר ה-primer שלו (ועוצר את החיתוך כשהוא מגיע ל-primer הבא שלו). כעת נעביר את 2 הגדילים אלקטרופורזה בג'ל. אם הגדילים הם זהים לחלוטין זה לזה, נקבל באלקטרופורזה שכל אורכי המקטעים החתוכים ב-2 הגדילים הם זהים זה לזה. לעומת זאת, אם בגדיל אחד חלה מוטציה באחד או יותר מאתרי ה-primer ובגדיל השני לא, אז באלקטרופורזה נקבל שבגדיל אחד אורכי הקטעים החתוכים הם שונים מהאורכים שבגדיל השני. אבל כיוון שמדובר בגדיל ובמשלים שלו, הם ממילא לא ייחתכו באותו מקום, כי אתרי ה-primer הם שונים, עקב כללי זיווג הבסיסים. האם הבנתי נכון?

שאלה נוספת: למה בדיוק משמשות השיטות PCR,Q-RT-PCR ושיטת PCR-rflp? מה ההבדלים ביניהן? האם הן משמשות לזיהוי הבדלים בין גדילי DNA או לשכפול מקטעי DNA קטנים יותר מאורך גדיל אחד שלם?

 

[גלקטור]

לא הבנת נכון

בPCR אין שימוש באנזימי רסטריקציה.
בתקופת האבן של הביולוגיה המולקולרית, אחת הדרכים לגלות הבדלים בין גנוטיפים שונים היתה ניתוח RFLP. הנה סרטון קצר שמסביר זאת: https://www.youtube.com/watch?v=ecZ0u0F7170
בשיטה זו אין שימוש בPCR; את הדטקציה על הג'ל עשו בשיטת Southern.
PCR היא שיטה להגברת מקטעי DNA באמצעות דנא פולימראז - אותו אנזים שמשכפל את הדנא בתאים. הנה סרטון: https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo
PCR-RFLP : במקום לחתוך את כל הגנום ואז לעשות סאות'רן, מגבירים בPCR את המקטע הרלוונטי, חותכים ומריצים על ג'ל. בגלל שהמקטע מוגבר פי 2 בחזקת 30 (או יותר) על פני שאר הגנום, אין בעיה לראות את המקטעים בעזרת צבע פלואורסנטי.

RT - רוורס טרנסקריפטאז - זהו אנזים שמשעתק דנא לפי תבנית של רנא (מקורו ברטרו-וירוסים דוגמת HIV). בRT-PCR קודם הופכים מקטעי רנא לדנא ואז מגבירים בשיטת PCR רגילה.
ה-Q הוא קיצור של quantitative שזו שיטה משוכללת יותר של PCR שמאפשרת כימות מדוייק של הדנא. נקראת גם real-time PCR. הנה סרטון: https://www.youtube.com/watch?v=edJEY5g4X8k

 

[amybr]

תודה רבה!

 

[Gidi Shemer]

אני צריך לרוץ אז עונה בסופר-קצרה

אין חיתוך של אנזימי רסטריקציה ב- pcr. רק ב pcr rflp יש שלב מאוחר יותר של חיתוך באנזימי רסטריקציה. pcr מבוסס על הפרדה בין הגדילים (דנטורציה), הוספת פריימרים ספציפיים שמתחברים לרצפים ספציים על הדנא, ואלוגנציה בעזרת דנא פולימרז. שלשת השלבים הללו חוזרים על עצמם מספר רב של פעמים עד שקטע בין הפריימרים ״משתלט״ כתוצר. ב- rt pcr מתווסף עניין הפיכת rna ל- cDNA.

 

[Gidi Shemer]

והעיקר ששכחתי לעשות רפרש

גלקטור כבר ענה בהרחבה